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  • 首页 > 试剂 > 分子生物学试剂 > DNA凝胶试剂盒100T
DNA凝胶试剂盒100T

产品细节图:

  • DNA凝胶试剂盒100T

DNA凝胶试剂盒100T

品牌:ECOTOP | 货号:EK-1101-100T
  • 所属大类 : 试剂
  • 所属小类 : 分子生物学试剂
  • 品牌 : ECOTOP
  • 规格 : 100T
  • 原价 : ¥250.00
  • 促销价 : ¥250.00
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    从各种浓度的琼脂糖凝胶中回收70bp-100Kbp DNA片段

    产品组成

    产品介绍
    本试剂盒采用可高效、专一结合 DNA 的硅基质材料和独特的缓冲液系统,可从各种浓度的 TAE 或
    TBE 琼脂糖凝胶上回收 70bp-10kbp 大小的 DNA 片段,同时除去蛋白质、其它有机化合物、无机盐离子
    及寡核苷酸引物等杂质,回收率可达 80%以上。每个离心吸附柱每次可吸附的 DNA 量为 20μg。使用本
    试剂盒回收的 DNA 可适用于各种常规操作,包括酶切、PCR、测序、文库筛选、连接和转化等实验。
    存储条件
    该试剂盒置于室温(15-25℃)干燥条件下,可保存 12 个月,更长时间的保存可置于 2-8℃。2-8℃
    保存条件下,Buffer QG 可能产生沉淀,使用前可在 55℃水浴中预热 10 min 以溶解。
    需要额外准备的材料
    □ 无水乙醇(96%-100%)
    □ 无菌 1.5ml 离心管
    开始前注意事项 请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。
    □ 电泳时最好使用新的电泳缓冲液,以免影响电泳和回收效果。
    □ 如下一步实验要求较高,核酸电泳时则应尽量使用 TAE 电泳缓冲液。
    □ 切胶时,紫外照射时间应尽量短,以免对 DNA 造成损伤。
    □ 如果回收率较低,可在胶充分溶解后检测 pH 值,如 pH 值大于 7.5,可向含有 DNA 的胶溶液中加
    10-30µl 3M 醋酸钠(pH5.2)将 pH 值调到 5-7 之间。
    □ 回收<70bp 或>10kb 的 DNA 片段时,应加大 Buffer QG 的体积,延长吸附和洗脱时间。
    □ 回收率与初始 DNA 量和洗脱体积有关,初始量越少、洗脱体积越少,回收率越低。
    □ 高温及潮湿等不利环境因素对吸附柱产生影响,请将吸附柱储存于阴凉干燥的环境中。
    开始前试剂准备
    □ 按瓶子标签所示,加入 4 倍体积的无水乙醇稀释 Buffer PW,于室温密封保存。
    □ 确认 Buffer QG 溶液显示为黄色。
    DNA 浓度及纯度检测
     回收得到的 DNA 片段可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。
     DNA 应在 OD260 处有显著吸收峰,OD260 值为 1 相当于大约 50μg/ml 双链 DNA、40μg/ml 单链DNA。
     OD260/OD280 比值应为 1.7-2.0,如果洗脱时不使用洗脱缓冲液,而使用 ddH2O 比值会偏低,因为pH 值和离子存在会影响光吸收值,但并不表示纯度低。
    操作步骤:
    1. 配制所需浓度的琼脂糖凝胶,电泳分离 DNA 片段。当 DNA 片段分离后,将凝胶置于紫外灯下,用干净锋利的手术刀快速切下含目的片段大小的 DNA 凝胶。为避免 DNA 片段受到损伤,应尽量减少凝胶的紫外照射时间,切胶时应尽量切去多余凝胶。
    2. 放入 1.5ml 离心管中并称取凝胶块的重量,加入 3 倍体积的 Buffer QG(如凝胶称重结果为 100mg,则其体积约等于100µl,应加入 300µl Buffer QG)。对于>2%的琼脂糖凝胶,添加 6 倍体积的 Buffer QG。
    3. 50℃水浴 10min(或直至凝胶完全溶解即可),水浴期间可颠倒混匀加速溶胶。
    注意:若回收<300bp 的 DNA 片段可在完全溶胶后加入一倍凝胶体积的异丙醇以提高回收率;胶块
    完全溶解后最好将溶液温度降至室温再上柱,因为吸附柱在室温时结合 DNA 能力较强。
    4. 凝胶完全溶解后,检查颜色是否为黄色(类似于没有溶解琼脂糖的 Buffer QG)。如果混合物的颜色为橙色或紫色,则加入 10µl 3 M 醋酸钠(pH 5.0)并混合,混合物的颜色会变成黄色。DNA 吸附到膜上仅在 pH ≤ 7.5 时有效。Buffer QG 含有一种 pH 指示剂,在 pH ≤7.5 时为黄色,在较高 pH 时为橙色或紫色,可通过颜色轻松确定 DNA 结合的最佳 pH。
    5.(选做)向上述溶胶液中加入 1 倍凝胶体积的异丙醇并混合。例如,如果琼脂糖凝胶切片为 100mg,则添加 100µl 异丙醇。此步骤增加了≤500bp 和≥4 kb 的 DNA片段的产量。对于 500bp-4kb 之间的 DNA 片段,添加异丙醇对产量没有影响。
    6. 将吸附柱套在 2ml 收集管中,并将上一步得到的溶液加入到吸附柱中,≥8000×g(≥10,000 rpm)离心 30s,倒掉收集管中的废液,将吸附柱放回收集管中。吸附柱最大容量为 700µl,若样品体积大于 700µl,可分批加入;为提高回收率,可短暂离心用于溶胶的 1.5ml 离心管后再将溶液转移如吸附柱。
    7. 向吸附柱中加入 500µl Buffer PW(已加入无水乙醇),≥8000×g(≥10,000 rpm)离心 30s,倒掉收集管中的废液,将吸附柱放回收集管中。
    注意:如果回收的 DNA 是用于盐敏感的实验,例如平末端连接实验或直接测序,建议加入 Buffer PW后静置 2-5min 后再离心。
    8. 重复操作步骤 7 一次
    9. 倒掉收集管中的废液后将吸附柱再次套入收集管中,最大转速 (~13,400×g)离心 2min 以干燥吸附柱膜,目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。将吸附柱套入新的1.5ml 离心管中并于室温开盖放置 5-10min 彻底晾干。注意:Buffer PW 中的乙醇残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR 等)实验。
    10. 向吸附柱膜中央位置悬空滴加 30-50µl Buffer EB,盖上盖子室温静置 2min 后,最大转速 (~13,400×g)离心 2min 收集 DNA 溶液并置于-20℃保存。
    注意:洗脱体积不应小于 30μl,体积过少影响回收效率。洗脱液的 pH 值对于洗脱效率有很大影响。若后续做测序,需使用 ddH2O 做洗脱液,并保证其 pH 值在 7.0-8.5 范围内,pH 值低于 7.0 会降低洗脱效率。为了提高 DNA 的回收量,可重复操作步骤 10 一次。
    常见问题:
    1.回收效率低
     凝胶未充分溶解:溶胶时,50~55℃水浴 10min,其间颠倒混匀数次,让凝胶充分溶解。
     凝胶用量过多:过量的凝胶会降低回收率,切胶时尽量去除多余的凝胶。
     溶胶液不足:3 倍体积的 Buffer QG 是为了保证在各种浓度的琼脂糖凝胶中都能有较好的回收率,尽量不要节省。
     洗脱不充分:建议用 Buffer EB 洗脱两次,以获得最高的回收率,洗脱液必须加入柱子的膜中央。
     试剂准备有误:Buffer PW 没有加入乙醇稀释或体积不准确(乙醇浓度需控制在 80%)。
    2. 回收后出现杂带
     DNA 变性:有些 DNA 片段对温度比较敏感,杂带有可能是单链的 DNA。降低溶胶温度至 37~50℃。降低温度,
    可延长溶胶时间至 20~40min 让凝胶充分溶解。
    3. 盐污染
     A260/230 太低:Buffer QG 溶液中的异硫氰酸胍在 A230 中有较高的吸收峰。使用该产品,A260/230 通常小于 1.0。
    实验表明,该产品得到的 DNA 不会影响下游的运用,包括测序,连接,定量 PCR,PCR,酶切等。
    4. 连接不理想
     乙醇污染:洗脱 DNA 前,打开柱子的盖子,空气干燥 10~15min 以彻底去除乙醇。
     核酸变性:降低溶胶温度至 37~50℃。降低温度,可延长溶胶时间至 20~40min 让凝胶充分溶解。降低温度能有
    效减少核酸的脱嘌呤和变性的影响。


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    期刊:《Scientific Reports 6, Article number: 29069 (2016)》 PMID:27353337

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