动物组织/细胞总RNA提取试剂盒（单柱法）100T

产品介绍
本试剂盒可以快速地从动物细胞中提取总 RNA。其提取的总 RNA 纯度高（存在基因组 DNA），
无蛋白质及其它杂质污染，可用于 RT-PCR、qPCR、cDNA 合成、引物延伸、芯片分析、Northern Blot、
Dot Blot、Slot Blot、Poly A 筛选、体外翻译、RNase 保护分析和分子克隆等多种下游实验。本产品仅供
科研使用，请勿用于医药、临床治疗、食品级化妆品等用途。
存储条件
Buffer RLT 可室温（15℃-25℃）干燥放置至少一年，加入 β-巯基乙醇的 Buffer RLT 可 4℃放置一个
月；其他试剂室温干燥保存可至少稳定 12 个月。
需要额外准备的材料
 14.3 M β-巯基乙醇(β-ME) (常规购买商业化商品即为 14.3 M)
 70%乙醇：RNase-free 水配制
 无水乙醇（96%-100%）
 无 RNase 酶的 1.5ml 离心管
 无 RNase 酶的枪头
 干净的手套
 高速离心机
 物理研磨设备
开始前注意事项 请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。
 操作前在 Buffer RLT 中加入 β-巯基乙醇（
β-ME）至终浓度为 1%（建议现配现用），如 1 ml Buffer RLT
中加入 10μl β-巯基乙醇。配好的 Buffer RLT 可在 4℃维持稳定一个月。
 Buffer RLT 在储存时可能会形成沉淀， 如果有沉淀出现，请 37℃加热溶解后室温使用。
 Buffer RW1 作为浓缩液提供，在第一次使用前加入 0.25 倍体积的乙醇（96-100％）以获得工作溶液。
 Buffer RPE 作为浓缩液提供，在第一次使用前加入 4 倍体积的乙醇（96-100％）以获得工作溶液。
 RNase-free 水中不含任何抑菌因子，室温放置或操作时可能会引入细菌或真菌污染，使用时尽量注意，
推荐开瓶后分装保存以减少污染风险保证实验稳定性。
 RNA 在 Buffer RLT 中时不会被 RNase 降解。但提取后继续处理过程中应使用不含 RNase 的无酶离心
管或玻璃器皿。
操作步骤：
1.
请根据样品种类进行以下步骤（1a 为动物细胞，1b 为动物组织）
1a. 收集动物细胞：悬浮细胞可直接 300×g 离心 5min 并仔细吸除上清留沉淀待使用；
单层贴壁细胞可通过直接裂解法（吸尽培养基留下贴壁细胞，待步骤 2 用 Buffer
RLT 裂解）或胰酶处理法（吸尽培养基留下贴壁细胞，用 PBS 清洗细胞，吸除 PBS
后使用含 0.10%-0.25%胰酶的 PBS 使细胞脱落，加入含有血清的培养基使胰酶失
活后转入 1.5ml 无酶离心管中 300×g 离心 5min，吸除上清留沉淀待使用）
注意：收集细胞数量不要超过 1×107，收集细胞时一定要将细胞培养基去除干净，否则会导致步骤 2 时细胞裂解
不完全，影响 RNA 与吸附柱的结合，导致 RNA 的产量降低。
2b. 动物组织匀浆裂解处理：
将 10mg-30mg 动物组织转移入 1.5ml 无酶离心管中并加
入 600μl Buffer RLT（动物组织量不要超过 30mg）使用前请检查 Buffer RLT 是否
加入 β-巯基乙醇，使用研磨杵或电动研磨机将动物组织彻底研磨匀浆。直接进行
步骤 3.
匀浆时间根据样本裂解难易程度决定，亦可匀浆后静置 3-5min 延长裂解时间（期间颠倒吹匀 2-3 次）。
2.
样品裂解：对于1a中使用直接裂解法的细胞应在培养皿或培养瓶中直接加入600μl
Buffer RLT（使用前请检查 Buffer RLT 是否加入 β-巯基乙醇）进行细胞裂解，之
后将裂解液全部吸入 1.5ml 无酶离心管中进行下一步操作。对于 1a 中使用胰酶处
理法的细胞应在无酶离心管中加入 600μl Buffer RLT 涡旋 1min 裂解并进行下一
步操作
若细胞量少于 5×106 可使用 350μl Buffer RLT。若细胞量较大，可涡旋后静置 3-5min 延长裂解时间（期间颠倒吹
匀 2-3 次）。
3.
将无酶离心管放入高速离心机以最大转速(~13,400×g)离心 3min。收集上清入新的
1.5ml 无酶离心管中，并加入 1 倍体积的 70%乙醇混匀。如 600μl 溶液则加入 600μl
70%乙醇。
配制 70%乙醇时请使用 RNase-free water。
4.
将步骤 3 混匀后的溶液转移入 RNase-free 吸附柱中并套上 2ml 收集管，
≥8000×g(≥10,000 rpm)离心 30s，弃废液。
吸附柱最大上柱量为 700μl，若溶液过多可分多次上柱。后续操作若无特殊说明吸附柱均置于 2ml 收集管中。
5.
向吸附柱中加入 700μl Buffer RW1（使用前请确认 Buffer RW1 是否按要求加入
0.25 倍体积无水乙醇）, ≥8000×g(≥10,000 rpm)离心 30s，弃废液。
6.
向吸附柱中加入 500μl Buffer RPE（使用前请确认 Buffer RPE 是否按要求加入 4
倍体积无水乙醇），≥8000×g(≥10,000 rpm)离心 30s，弃废液。
7.
重复步骤 6 一次。
8.
倒弃滤液，将吸附柱放入收集管中, 以最大转速(~13,400×g)离心 3min 干燥柱膜。
9.
将吸附柱套入新的无酶 1.5ml 离心管管中，并置于无酶的环境中开盖静置 5-10min
至乙醇晾干。
若吸附柱中残留乙醇将会对纯化后的 RNA 的下游实验造成影响。
10. 向吸附柱膜正中央加入 50-100μl RNase-free Water，盖上盖子室温静置 3-5 min。
后置于离心机中 ≥12,000×g(≥13,000 rpm) 离心 3min 得到 RNA 溶液。
RNA 洗脱体积不应少于 30μl，否则影响洗脱效率。洗脱后的 RNA 溶液应置于-80℃储存。
RNA 纯度及浓度检测
纯度：OD260/OD280 比值是衡量蛋白质污染程度的指标。高质量的 RNA，OD260/OD280 读数在 1.8-2.1
之间，比值为 2.0 是高质量 RNA 的标志。OD260/OD280 读数受测定所用溶液的 pH 值影响。同一
个 RNA 样品，假定在 10 mM Tris pH7.5 溶液中测出的 OD260/OD280 读数 1.8-2.1 之间，在水溶液
中所测读数则可能在 1.5-1.9 之间，但这并不表示 RNA 不纯。
浓度：取一定量的 RNA 提取物，用 RNase-free ddH2O 稀释 n 倍，用 RNase-free ddH2O 将分光光度计
调零，取稀释液进行 OD260, OD280 测定，按照以下公式进行 RNA 浓度的计算：
终浓度（ng/μl）= (OD260)×(稀释倍数 n)×40