NCM/新赛美 快速重组无缝克隆试剂盒

产品介绍 

EasyFusion Assembly Master Mix 是一种快速、简单且高效的定向同源重组克隆试剂盒，可将目的片段一个或多个 （PCR 产物）定向克隆到任意载体的任意位置。该技术不依赖于 T4 连接酶、不受载体和目的片段的酶切位点限制， 仅需 15-30 分钟实现高效无缝连接。 

操作步骤

1.线性化载体准备 

可以通过以下两种方法获得线性化载体，最终载体的浓度需>10 ng/μl。(高浓度的载体有利于提高效率)。

（1）选择合适的酶切位点线性化载体。（单酶切或双酶切均可， 5´端突出、3´端突出或平末端均适用）

（2）以载体为模板，设计引物，通过 PCR 的方式扩增出需要的线性化载体 

2.扩增插入片段引物设计 

通常通过 PCR 获得目的片段，引物设计要保证目的片段两端有至少 15bp-20bp 序列与线性化载体的两端一致的 同源序列。PCR 每条引物长度至少在 35-40bp 之间，包括 5´ 端和 3´端与线性载体同源的 15bp-20bp（不包括酶 切位点）以及目的片段特异性序列 20-25bp。

（1）单个片段的引物设计：

引物包含目的基因特异性序列和重叠序列 插入片段正向扩增引物设计方式为： 5´-上游载体末端 15-20bp 同源序列+目的基因特异性正向扩增引物序列(20-25bp)-3´ 插入片段反向扩增引物设计方式为： 5´-下游载体末端 15-20bp 同源序列+目的基因特异性正向扩增引物序列(20-25bp)-3´ 设计引物时，可以参考以下实例（以 pUC19 线性化载体为例）：

3.PCR 扩增插入片段

推荐使用高保真聚合酶进行 PCR 扩增插入片段，以减少扩增突变的产生，选择聚合酶时无需考虑末端有无 A 加尾 发生（重组过程中将会被去除，在最终载体中不会出现）。PCR 扩增结束后，对目的 PCR 产物进行纯化：若是扩增模 板与克隆载体抗性不同，且 PCR 产物条带电泳单一，产物可以无需纯化直接用于重组反应，或者对 PCR 产物进行脱盐 等简单纯化；否则，需要进行琼脂糖凝胶电泳回收特异性的目的 PCR 片段。 4.重组反应进行 取出 EasyFusion Assembly Master mix, 置于冰浴中，配制下图应体系（如果不慎将液体粘在管壁，可通过短暂离心沉降）

注意：10 ul 反应体系中，载体和各插入片段建议量在 20-50ng 之间，载体与各插入片段的最佳摩尔比为 1:2-1:3 

轻轻混匀反应体系，50℃反应 15-30 分钟（对于多片段重组或大片段重组，建议反应时间 30 分钟，可延长反应时 间至 1 小时）；待反应结束后，将离心管置于冰上冷却数秒，之后将重组产物保存于-20℃或用于转化。 

5. 反应产物转化、涂板及克隆鉴定 建议所使用的感受态细胞效率要达到> 5X 107 cfu/ug。转化步骤按照不同菌种的要求进行或者按标准转化操作 进行即可。菌落长出之后，建议采用菌落 PCR 进行阳性克隆鉴定，或者对样品进行测序确保正确。

保存条件及组成成分 

-20℃保存及冰袋运输 组成成分：2X EasyFusion Assembly Master Mix , 125ul; Linearized pUC19 Vector (10ng/ul),5ul;Control Insert（0.5kb, 20ng/ul),5ul

注意事项 

1. 线性化载体或目的片段的纯化的品质及浓度等较差会显著降低克隆阳性率及克隆数。

2. 重组质粒大小的增加（>12kb），克隆效率会显著降低，选择稳定性更好的感受态及转化效率更高效的感受态细胞。

3. 菌落较少时，建议适当增加重组反应产物的体积量，或者提高转化产物量等。

4. 随着重组片段数目的增加，克隆效率降低，建议增加引物重叠序列长度或适当延长反应时间。