无内毒素质粒小提中量试剂盒

储存条件

本试剂盒在室温（15-25℃）干燥条件下，可保存12个月；更长时间的保存可置于2-8℃。（注意：当低温贮存时，使用前应先将试剂盒内的溶液在室温中放置一段时间，必要时可在37℃水浴中预热10 min，以平衡溶液温度）。单独包装的RNase A在室温可稳定保存12个月以上。加入RNase A后的溶液P1应置于2-8℃保存，可稳定保存6个月。

产品简介

本试剂盒采用独特的硅胶膜吸附技术，高效专一地结合质粒DNA。同时采用特殊的去内毒素溶液ER和过滤柱CS1，可有效的去除内毒素、蛋白等杂质；整个提取过程仅需1个小时，方便快捷。以下操作步骤适用于提取5-15 ml过夜培养的大肠杆菌,质粒提取得率和质量与宿主菌的种类和培养条件，细胞的裂解，质粒拷贝数，质粒的稳定性，抗生素等因素有关。

使用本试剂盒提取的质粒DNA可适用于转染多种细胞及各种常规操作，包括酶切、PCR、测序、连接等实验。

注意事项 请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。

1.溶液 P1 在使用前先加入 RNase A（将试剂盒中提供的 RNase A 全部加入），混匀，置于 2-8℃保存。

2.使用前先检查溶液 P2 和 P3 是否出现浑浊，如有混浊现象，可在 37℃水浴中加热几分钟，即可恢复澄清。

3.所有离心步骤均为使用台式离心机室温下进行离心，速度为 12,000 rpm (~13,400×g )。

4.去内毒素溶液 ER 在多次开盖使用后，可能会有细微的颜色变化，不影响最终质粒提取效率和纯度。

5.提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于 10 kb 的大质粒，应加大菌体使用量，同时按比例增加 P1、P2、P3 的用量，洗脱缓冲液应在 65-70℃预热。可以适当的延长吸附和洗脱的时间，以增加提取效率。

操作步骤

使用前请先在漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。 本产品仅供科研使用，请勿用于临床诊断及其它用途

1.取5-15 ml过夜培养的菌液加入离心管中，12,000 rpm (~13,400×g ) 离心1 min，尽量吸除上清。

注意：菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中, 菌体量以能够充分裂解为佳，过多的菌体裂解不充分会降低质粒的提取效率。

2.向留有菌体沉淀的离心管中加入500 μl溶液P1 （请先检查是否已加入RNaseA），使用移液器吸吐或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。

注意：请务必彻底悬浮细菌沉淀，如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。

3.向离心管中加入500 μl溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。

注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免污染基因组DNA。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5 min，以免质粒受到破坏。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。

4.向离心管中加入500 μl溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀，然后室温放置10 min左右，12,000 rpm (~13,400×g ) 离心10 min，此时在离心管底部形成沉淀。

注意：P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。

5.将上一步收集的上清液分次加入过滤柱CS1（过滤柱放入收集管中），12,000 rpm(~13,400×g ) 离心2min，小心地将过滤离心后收集管中得到的溶液分次加入吸附柱CP2中（吸附柱放入收集管中），（如果过滤柱中有残余的液体，说明步骤4的上清中杂质过多，可以延长离心的时间；如果离心后收集管底部有少量的沉淀，尽量地吸取上清）。

6.12,000 rpm (~13,400×g ) 离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP2放入收集管中。

7.向吸附柱CP2加入750 ml 去内毒素溶液ER（已经加入异丙醇），静置2分钟使管柱膜平衡，室温12,000rpm (~13,400×g)离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

8.向吸附柱CP2中加入700 μl漂洗液PW（请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm(~13,400×g ) 离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP2放入收集管中。

注意：加入漂洗液PW后，如果室温静置2-5 min，有助于更好地去除杂质。

9.重复操作步骤8.

10.将吸附柱CP2重新放回收集管中，12,000 rpm (~13,400×g ) 离心2 min，目的是将吸附柱中残余的漂

洗液去除。

注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱CP2开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的乙醇。

11.将吸附柱CP2置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100-300 μl洗脱缓冲液TB，室温放置2 min，12,000 rpm (~13,400×g ) 离心1 min将质粒溶液收集到离心管中。

注意：洗脱缓冲液体积不应少于100μl，体积过小影响回收效率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响，若后续做测序，需使用ddH2O做洗脱液，并保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率。且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。为了增加质粒的回收率，可将得到的溶液重新加入吸附柱中，室温放置2 min，12,000 rpm(~13,400×g) 离心2 min，将质粒溶液收集到离心管中。