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培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒

产品细节图:

  • 培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒

培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒

品牌:genefist | 货号:GF430
  • 所属大类 : 试剂
  • 所属小类 : 常用生化试剂
  • 品牌 : genefist
  • 规格 : 50次
  • 原价 : ¥1024.00
  • 促销价 : ¥1024.00
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    溶菌酶(50mg/ml)目录号:GF0203-01,客户自备,提取细菌总 RNA 时需配备
    储存条件
    DNase I(为DNase I 冻干粉溶解于专用保存液),储存于-20℃;
    其他试剂室温(15-25℃)保存。
    产品简介
    培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒,提供了快速简单且有效的方法,可从培养细胞和细菌中提取总RNA。本试剂盒采用离心管柱的方式,配合使用我司独特的硫氰酸胍裂解液,使细胞或细菌裂解及均质化,并加入乙醇使RNA选择性的与管柱膜结合,于操作过程中加入DNase Ⅰ以去除残留的基因组DNA,经过多次“洗涤及离心”的步骤去除污染杂质,再以无核酸酶水回收结合在管柱膜上的RNA。若RNA小于200nt,如5sRNA、tRNA和microRNA,无法在此系统中被有效地回收。提取的总RNA纯度高,基本没有DNA和蛋白质污染,可用于PCR、芯片分析、Blot、PolyA 筛选、体外翻译、RNase 保护分析和分子克隆等多种下游实验。
    预防RNase污染,应注意以下几方面
    1.经常更换新手套,因为皮肤经常带有细菌,可能导致RNase污染。
    2.使用无RNase的塑料制品和枪头避免交叉污染。
    3.RNA在裂解液RL中时不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4 h,塑料器皿可在0.5 M NaOH中浸泡10 min,然后用水彻底清洗,再灭菌,即可去除RNase。
    4.配制溶液应使用无RNase的水(将水加入到干净的玻璃瓶中,加入DEPC至终浓度0.1%(V/V),高压灭菌)。
    使用前注意事项
    1.裂解液 RL:使用前请添加 300ul 巯基乙醇,添加过巯基乙醇的裂解液 4℃保存。
    2.漂洗液 PW:使用前请添加 64ml 无水乙醇。
    3.为确保 RNA 的品质及产量,应尽量收取新鲜的动物组织进行 RNA 提取,或将组织立即以液氮冷冻,储存于-70℃,组织亦可保存在 RANstore 样本保存液(目录号:TR38)中。样本保存在 RNAstore 试剂中,可于37℃存放 1 天、4℃存放 1 个月、-20℃永久保存,所提取的 RNA 品质与储存在液氮中相同。
    操作步骤
    一、从培养细胞中提取总 RNA
    1.收集细胞
    a.悬浮细胞的收集(收集细胞数量请不要超过 1×107):估计细胞数量,300×g 离心 5 min,将细胞收集到离心管中,仔细吸除所有培养基上清。
    b.单层贴壁细胞的收集(收集细胞数量请不要超过 1×107):可直接在培养容器中裂解(容器直径不超过10 cm),或者使用胰蛋白酶处理后离心收集细胞沉淀。(在摇瓶中培养的单层贴壁细胞通常采用胰蛋白酶处理的方法。)
    直接裂解法:确定细胞数量,彻底吸除细胞培养基上清,立即进行第 2 步裂解步骤。
    胰蛋白酶处理法:确定细胞数量,吸除培养基,用 PBS 洗涤细胞,吸除 PBS,向细胞中加入含有0.10-0.25%胰蛋白酶的 PBS 处理细胞,当细胞脱离容器壁时,加入含有血清的培养基失活胰蛋白酶,将细胞溶液转移至 RNase-Free 的离心管中,300×g 离心 5 min,收集细胞沉淀,仔细吸除所有上清。
    注意:收集细胞时一定要将细胞培养液去除干净,否则会导致裂解不完全,影响 RNA 与吸附柱的结合,
    造成 RNA 的产量降低;请勿使用过多的样本量,避免管柱杜塞而造成 RNA 的产量降低。
    2.裂解处理
    a.对于离心得到的细胞沉淀:轻弹离心管底部,使细胞沉淀松散,加入适量裂解液 RL(详见下表,使用

    3.将所有溶液转移至过滤柱 CS1 上(过滤柱 CS1 放在收集管中),12,000 rpm(~13,400×g)离心 2min,收集滤液。
    4.向滤液加入等体积 70%乙醇至裂解液中,混匀(此时可能会出现沉淀)。
    5.将“裂解液/乙醇混合液”(含沉淀)移取至吸附柱 CR1 中(吸附柱 CR1 放入收集管中),12,000 rpm (~13,400×g )离心 30-60 sec,倒掉收集管中的废液,将吸附柱 CR1 放回收集管中。
    注意:将溶液和沉淀转移至吸附柱 CR1 时,如果体积大于吸附柱容量,可以分次完成。
    6.向吸附柱 CR1 加入 500ul 溶液 RW,12,000 rpm (~13,400×g )离心离心 1 min,丢弃滤液。
    7.DNase Ⅰ降解。
    每一纯化反应,请将 80 ul DNase 消化液与 10ul DNaseⅠ预先混合在新的离心管(轻弹或翻转离心管以混合均匀,请勿震荡),将 90 ul “DNaseⅠ工作液”加入至吸附柱的膜中心,于室温(25~28℃)孵育15 分钟。
    注意:如同时操作多组样本,请使用前现配新鲜的 DNaseⅠ工作液,请勿预先配制保存 DNaseⅠ工作液。
    8.向吸附柱 CR1 中加入 500μl 溶液 RW,12,000 rpm(~13,400×g)离心 1 min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱 CR1 放回收集管中。
    9.向吸附柱 CR1 中加入 600μl 漂洗液 PW(使用前请先检查是否已加入乙醇),12,000 rpm(~13,400×g) 离心 1 min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱 CR1 放回收集管中。
    10.重复操作步骤 9。
    11.12,000 rpm(~13,400×g)离心 3 min,将吸附柱 CR1 置于室温放置数分钟,以彻底晾干吸附材料中残余的乙醇。
    注意:此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除,离心后将吸附柱 CR1 在室温放置片刻,以充分晾干。如果有漂洗液残留,可能会影响后续的 RT 等实验。
    12.将吸附柱 CR1 转入一个新的 RNase-Free 离心管中,加入 30-100 μl 无酶双蒸水至吸附柱的膜中心,室温静置 2 min,12,000 rpm(~13,400×g)离心 1 min,得到 RNA 溶液。
    注意:洗脱缓冲液体积不应少于 30 μl,体积过小影响回收效率;RNA 溶液请于-70℃保存。
    二、从细菌中提取总 RNA
    1.4℃12,000 rpm(~13,400×g)离心 2 min 收集菌体(收集菌体的最大量不超过 1×109),仔细去除所有培养基上清,以后的所有离心步骤均在室温(20-25℃)进行。
    注意:如果培养基上清去除不完全,将对第二步中的细胞壁消化过程产生抑制。
    2.用含有溶菌酶的 100μl TE 缓冲液(客户自己配制,配制方法见下表)彻底重悬菌体,孵育时间见下表。

    3.加入 350μl 裂解液 RL(使用前请先检查是否已加入β-巯基乙醇),涡旋振荡混匀。
    4.将裂解混合液转移至过滤柱 CS1 上(过滤柱 CS1 放入收集管),12,000 rpm(~13,400×g)离心 2min,收集滤液。
    5.向滤液中加入 250μl 无水乙醇,混匀(此时可能会出现沉淀)。
    6.将“裂解液/乙醇混合液”(含沉淀)移取至吸附柱 CR1 中(吸附柱 CR1 放入收集管中),12,000 rpm (~13,400×g )离心 30-60 sec,倒掉收集管中的废液,将吸附柱 CR1 放回收集管中。
    注意:将溶液和沉淀转移至吸附柱 CR1 时,如果体积大于吸附柱容量,可以分次完成。
    7.向吸附柱 CR1 中加入 500ul 溶液 RW,12,000 rpm (~13,400×g )离心离心 1 min,丢弃滤液,将吸附柱CR1 放回收集管中。
    8.DNase Ⅰ降解。
    每一纯化反应,请将 80 ul DNase 消化液与 10ul DNaseⅠ预先混合在新的离心管(轻弹或翻转离心管以混合均匀,请勿震荡),将 90 ul “DNaseⅠ工作液”加入至吸附柱的膜中心,于室温(25~28℃)孵育15 分钟。
    注意:如同时操作多组样本,请使用前现配新鲜的 DNaseⅠ工作液,请勿预先配制保存 DNaseⅠ工作液。
    9.向吸附柱 CR1 中加入 500μl 溶液 RW,12,000 rpm(~13,400×g)离心 1 min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱 CR1 放回收集管中。
    10.向吸附柱 CR1 中加入 600μl 漂洗液 PW(使用前请先检查是否已加入乙醇),12,000 rpm(~13,400×g)离心 1 min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱 CR1 放回收集管中。
    11.重复操作步骤 10。
    12.12,000 rpm(~13,400×g)离心 3 min,将吸附柱 CR1 置于室温放置数分钟,以彻底晾干吸附材料中残余的乙醇。
    注意:此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除,离心后将吸附柱 CR1 在室温放置片刻,以充分晾干。如果有漂洗液残留,可能会影响后续的 RT 等实验。
    13.将吸附柱 CR1 转入一个新的 RNase-Free 离心管中,加入 30-100 μl 无酶双蒸水至吸附柱的膜中心,室温静置 2 min,12,000 rpm(~13,400×g)离心 1 min,得到 RNA 溶液。
    注意:洗脱缓冲液体积不应少于 30 μl,体积过小影响回收效率;RNA 溶液请于-70℃保存。

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