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血液总RNA提取试剂盒
产品细节图:
血液总RNA提取试剂盒
品牌:genefist | 货号:GF443
所属大类
: 试剂
所属小类
: 常用生化试剂
品牌
: genefist
规格
: 50次
原价
: ¥1104.00
促销价
:
¥1104.00
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储存条件
DNase I(DNase I 冻干粉溶解于专用保存液),储存于-20℃;
其他试剂室温(15-25℃)保存。
产品简介
本试剂盒可从新鲜全血中有效提取总RNA,可处理不同物种以及多种抗凝剂全血样品。吸附柱中采用的硅基质材料为本公司新型材料,专一吸附RNA,配合我司高效的缓冲液体系,可有效去除杂质蛋白。提取的RNA可用于PCR、芯片分析、Blot、PolyA 筛选、体外翻译、RNase 保护分析和分子克隆等多种下游实验。
本试剂盒不适用于冻存的全血。
预防RNase污染,应注意以下几方面
1.经常更换新手套,因为皮肤经常带有细菌,可能导致RNase污染。
2.使用无RNase的塑料制品、玻璃器皿和枪头,避免交叉污染。
3.RNA 在裂解液 RLH 中时不会被 RNase 降解。但提取后继续处理过程中应使用不含 RNase 的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在 150℃烘烤 4 h,塑料器皿可在 0.5 M NaOH 中浸泡 10 min,然后用水彻底清洗,再灭菌,即可去除 RNase。
4.配制溶液应使用无RNase的水(将水加入到干净的玻璃瓶中,加入DEPC至终浓度0.1%(V/V),高压灭菌)。
使用前注意事项
1.裂解液 RL:使用前请添加 300ul 巯基乙醇,添加过巯基乙醇的裂解液 4℃保存。
2.漂洗液 PW:使用前请添加 64ml 无水乙醇。
3.人类的血液或体液可能有潜在的感染性,所以如果对人类的全血进行处理,请注意做好防护措施。
4.本试剂盒最多能处理1.5 ml健康的人类全血(健康人的全血中白细胞含量为:最多4000- 7000个白细胞/μl血液),如果血液中白细胞的含量较高,可按比例减少血液的用量,本试剂盒最多可处理的白细胞数量为:1×107 。
5.在白细胞裂解后,该说明书中的所有步骤需在室温(15-25℃)进行,操作速度越快越好。
6.细胞溶解物(在裂解液RLH中)可以存放在-70℃,待使用时,将其置于37℃孵育10 min,以保证所有的盐都溶解,然后进行操作步骤第7步。
7.本试剂盒不适用于冻存的全血。
操作步骤
1.红细胞裂解液的稀释:根据处理血液样品的体积选取适当体积的 10×红细胞裂解液(例如待处理的血液样品体积为 200 μl,则取 140 μl 10×红细胞裂解液),用无酶双蒸水稀释成 1×红细胞裂解液。
2.向 1 体积人类全血中加 5 倍体积 1×RBC 裂解液 (需自备合适的干净管子)。
注意:为获得最佳的混匀效果,血液和 1×红细胞裂解液的混合液体积不应超过管子体积的 3/4。如果血液中的白细胞含量较高,可按比例减小血液的使用体积,第 5 步中的 1×红细胞裂解液的使用体积也要进行相应调整。
3.冰上孵育 10-15 min,在孵育过程中涡旋振荡混匀 2-3 次。
注意:在孵育过程中溶液将变成半透明状态,表明红细胞裂解。如果必要的话,孵育时间可延长至 20 min。
4.4℃ 2,100 rpm (~400×g) 离心 10 min,将上清完全去除。
注意:离心后白细胞可能会形成小球,确保完全去除上清,痕量红细胞的存在,会使白细胞小球呈现红色,而该现象会在随后的漂洗步骤中消失。
5.向白细胞沉淀中加入 1×红细胞裂解液(加入 1×红细胞裂解液的体积是第 1 步中全血用量的 2 倍),重悬细胞。
6.4℃,2,100 rpm (~400×g) 离心 10 min,将上清完全去除。
注意:如果上清去除不完全将会影响裂解及随后的 RNA 与膜的结合,导致最后 RNA 产率降低。
7.向白细胞沉淀中加入裂解液 RLH (使用前请先检查是否已加入 β-巯基乙醇),具体加量按照下表进行,涡旋或使用移液器混匀。
注:如果血液不是健康人的全血,需要根据血液中白细胞的数量来确定所需裂解液 RLH 的体积,此时细胞应完全裂解,块状细胞沉淀消失
8.将溶液转移至过滤柱 CS1 中 (过滤柱 CS1 放在收集管中),12,000 rpm (~13,400×g) 离心 2 min,弃去过滤
柱 CS1,收集滤液。
注意:为避免气溶胶的形成,请将移液器调整到≥750µl 以保证一次性将所有溶液转移到过滤柱上,如果
细胞太多,将会出现裂解液粘稠的现象,造成难以吸取的情况。
9.向滤液中加入 1 倍体积 70%乙醇(通常为 350 μl 或 600 μl),混匀(此时可能会出现沉淀),得到的溶液和沉
淀一起转入吸附柱 CR2 中(吸附柱 CR2 放入收集管中),12,000 rpm (~13,400×g) 离心 30-60sec,倒掉收集
管中的废液,将吸附柱 CR2 放回收集管中。
注意:配制 70%乙醇时请使用 RNase-Free ddH2O,如果滤液体积有所损失,请相应减少 70%乙醇用量。
将溶液和沉淀转移至吸附柱 CR2 时,体积大于吸附柱容量,可以分两次完成。
10.将所得“裂解液/乙醇混合液”(含沉淀),移取至吸附柱 CR2 中(吸附柱 CR2 放入收集管中),12,000 rpm
(~13,400×g )离心 30-60 sec,倒掉收集管中的废液,将吸附柱 CR2 放回收集管中。
注意:将溶液和沉淀转移至吸附柱 CR2 时,如果体积大于吸附柱容量,可以分次完成。
11.向吸附柱 CR2 加入 500ul 溶液 RW,12,000 rpm (~13,400×g )离心离心 1 min,丢弃滤液,将吸附柱 CR2
放回收集管中。
12.DNase Ⅰ降解。
每一纯化反应,请将 80 ul DNase 消化液与 10ul DNaseⅠ预先混合在新的离心管(轻弹或翻转离心管
以混合均匀,请勿震荡),将 90 ul “DNaseⅠ工作液”加入至吸附柱的膜中心,于室温(25~28℃)孵育
15 分钟。
注意:如同时操作多组样本,请使用前现配新鲜的 DNaseⅠ工作液,请勿预先配制保存 DNaseⅠ工作液。
13.向吸附柱 CR2 中加入 500μl 溶液 RW,12,000 rpm(~13,400×g)离心 1 min,倒掉收集管中的废液,将
吸附柱 CR2 放回收集管中。
14.向吸附柱 CR2 中加入 600μl 漂洗液 PW
(使用前请先检查是否已加入乙醇)
,12,000 rpm(~13,400×g)
离心 1 min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱 CR2 放回收集管中。
15.重复操作步骤 14。
16.12,000 rpm(~13,400×g)离心 3 min,将吸附柱 CR2 置于室温放置数分钟,以彻底晾干吸附材料中残余
的乙醇。
注意:此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除,离心后将吸附柱 CR2 在室温放置片刻,以充分晾干。
如果有漂洗液残留,可能会影响后续的 RT 等实验。
17.将吸附柱 CR2 转入一个新的 RNase-Free 离心管中,加入 30-100 μl 无酶双蒸水至吸附柱的膜中心,室
温静置 2 min,12,000 rpm(~13,400×g)离心 1 min,得到 RNA 溶液。
注意:洗脱缓冲液体积不应少于 30 μl,体积过小影响回收效率;RNA 溶液请于-70℃保存。
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1.
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作者:Jianhong Zhou ,Lingzhou Zhao 影响因子:4.259
期刊:《Scientific Reports 6, Article number: 29069 (2016)》 PMID:
27353337
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