Western印迹法，也被称为Westernbloter、Westernblotting，是检测蛋白质的重要方法之一。

其操作流程如下：

1.细胞裂解：将待检样品进行机械或化学裂解，以释放蛋白质。
2.SDS-PAGE电泳：将蛋白质样品加入SDS-PAGE凝胶，根据分子量大小进行电泳分离。
3.转印：将分离的蛋白质迁移到聚丙烯酰胺凝胶薄膜（PVDF）或硝酸纤维素薄膜上。
4.封闭：使用阻断剂（例如非脂乳精或牛血清白蛋白）封闭薄膜上未被蛋白质占据的位置，防止非特异性结合。
5.抗体孵育：将特异性抗体与薄膜上的目标蛋白质结合，形成免疫复合物。
6.洗涤：洗去未结合的抗体和其他杂质。
7.二次抗体孵育：加入与第一抗体亲和的酶标记二抗，形成免疫复合物。
8.洗涤：洗去未结合的二次抗体和其他杂质。
9.显色：使用酶底物或荧光标记物，使免疫复合物产生可见的信号。
10.影像分析：使用成像系统记录并分析蛋白质带的强度和大小。
以上是WesternBlotting的操作流程，广泛应用于蛋白质检测和研究中。

下面简要介绍了WesternBlotting实验的步骤。
1、材料组织：对组织块进行称重
2、通过使用液氮，可以破碎组织样本。
3、将RIPA缓冲液添加到每克组织中，每克组织的RIPA缓冲液用量为3ml。然后，将PMSF加入到每克组织中，PMSF浓度为10mg/ml，每克组织需要添加30μl的PMSF。
请将样品保持在4℃，然后使用Polytron进行进一步的匀浆（15,000转/分，持续1分钟）。
4、在每克组织中加入PMSF（每克30毫升）示，PMSF浓度为10毫克/毫升）。然后将样品放在冰上孵化30分钟。
5、将样品放入离心管中，将离心管放入离心机中，在4℃下进行离心操作，设置离心力约为20,000g（约15,000转速），离心时间为15分钟。
6、细胞裂解液即为上清液，可以被储存在-20℃的容器中。
7、使用布拉德福比色法来测定蛋白质的浓度。
8、取相同质量的细胞裂解液，其体积和蛋白浓度保持不变，然后加入等量的2×电泳样品缓冲液。
9、将水煮沸后，将东西浸泡在热水中三分钟。
上样
11、电泳过程中使用20mA的浓缩胶和35mA的分离胶。
12、电转膜仪通过电流转移膜(100mA40分钟)。
13、薄膜采用丽春红进行染色，而胶则使用考马斯亮蓝进行染色。
14、进行Westernblot实验时，可以使用试剂盒进行着色。
15、分析比对记录

进行WesternBlotting的具体实验步骤如下：
以下操作程序供西方参考：
1、进行蛋白质样品收集(Proteinsamplecollection)
可以使用适当的溶解液对贴壁细胞、悬浮细胞或组织样本进行裂解。对于一些特定的亚细胞组分蛋白，例如细胞核蛋白、细胞质蛋白、线粒体蛋白等，可以通过参考相关文献的方法提取，也可以使用试剂盒来提取。
在收集蛋白质样品后，需要检测每个样品的蛋白质浓度，以确保它们的上样量一致。根据使用的裂解液不同，我们需要选择合适的方法来测量蛋白质浓度。不同的蛋白质浓度测量方法在去垢剂和氧化剂方面存在兼容性差异。如果我们使用的是北京博奥森生物技术有限公司生产的WIP细胞裂解液，我们可以选择使用BCA蛋白浓度测量试剂盒。
2、电泳，又称为电泳分离技术，是一种基于电场效应的物质分离方法。它利用带电物质在电场中的迁移速度不同，通过电场驱动，将混合物中的物质分离开来。电泳广泛应用于生物化学、生物医学、生命科学等领域，以实现样品分离、纯化、定性和定量分析等。
（1）、准备SDS-PAGE胶液
可以参考一些文献，来制备SDS-PAGE电泳凝胶，并且也能使用由博奥森制造的SDS-PAGE疑胶制备试剂盒进行制备。该试剂盒包括配方制备不同浓度SDS-PAGE所需的所有试剂（除了水和凝胶制备器具）。
样品处理
将适量的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液加入到收集的蛋白样品中。例如，可以使用2X或5X浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。使用5X的缓冲液可以减少上样的体积，从而在相同的上样孔中能够上样更多的蛋白。可以按照相关文献制备5X浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，也可以使用博奥森公司制造的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（5X）。在100℃或热水中加热3-5分钟，以确保蛋白质得到充分变性。
上样与电泳
在冷却至室温后，可以将蛋白质样品直接置于SDS-PAGE胶的样品孔中。为了更方便地观察电泳性能和转膜效果，并判断蛋白质的分子量，最好使用预先染色的蛋白质含量标准。
进行电泳实验时，通常建议在样品加载到上胶之前使用低压恒压电泳。而当溴酚蓝进入下胶后，建议使用高压恒压电泳。对于Bio-Rad的标准电泳装置或类似装置，低压可以设置在80-100V之间，而高压则可以设置在约120V左右。如果进行SDS-PAGE实验，可以使用普通的电泳仪来满足要求。另外，为了方便电泳操作，可以采用SDS-PAGE全程恒压的方法。一般来说，可以将电压设置为100V，然后将时间设置为90至120分钟。通过设置合适的时间，可以避免频繁进行电泳操作。
在一般的电泳过程中，可以通过以下两种方式来结束电泳：一是等到溴酚蓝染料达到胶的底部周围停止电泳，二是根据预先设定的蛋白质含量标准来结束电泳。根据预期的分离效果，当目的蛋白质经过适度的分离后，可以选择结束电泳过程。
3、膜转移技术
针对Western实验，我们建议选择PVDF膜。不过，你也可以选择硝酸纤维素膜（NC膜）或PVDF膜（二氟化树脂膜孔径为0.45um）。需要注意的是，硝酸纤维素膜相对脆弱，在操作过程中容易破裂，特别是用镊子夹住的时候。所以在使用时请参考制造商推荐的使用步骤。
一般来说，使用Bio-Rad标准的湿式膜转换设备时，推荐的膜转换电压设置为120V，膜转换时间为30-60分钟。具体的膜转换时间应根据目的蛋白质的分子量而定。如果目的蛋白质的分子量较大，那么所需的膜转换时间就会更长一些；而如果目的蛋白质的含量较低，那么所需的膜转换时间就会相应减少。
在进行转膜过程中，尤其是高电流快速转膜时，通常会出现严重的发热现象。为了最佳效果，建议将转膜槽放置于冰浴中进行转膜。可以通过观察使用的预染蛋白质含量标准来评估转膜效果，通常来说，最大的1-2个杂带较难完全转移到膜上。另外，通过使用丽春红染色液来染色膜，也可以观察转膜的实际效果。而使用考马斯亮蓝快速染色液来染色完成转膜的SDS-PAGE胶，可以观察蛋白质的残留情况。
4、封闭(Blocking)
转膜完成后，应立即将蛋白膜放入预先准备好的Western洗涤液中，冲洗1-2分钟，以去除膜上的转膜液。在转膜完成后的整个过程中，务必注意保持膜的湿润，避免膜干燥，否则可能导致较高的背景信号产生。
使用微型台式真空泵抽取洗涤液，然后加入Western封闭液，在摇床上缓慢摇动，在室温下封闭60分钟。对于一些高背景的抗体，可以在4℃条件下封闭一夜。
5、主要抗体孵育
根据Western一抗说明书的指导，以适当的比例稀释Western一抗稀释液。
使用微型台式真空泵吸取封闭液后，立即添加稀释好的抗体，并在室温或4℃的侧摆摇床上缓慢摇晃孵化一小时。若一小时的孵化效果不佳，可以在4℃下继续缓慢摇晃孵化一晚上。之后回收抗体，加入Western洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇晃清洗5-10分钟。吸取洗涤液后，再次加入洗涤液进行清洗5-10分钟，总共进行3次清洗。若结果的背景较高，可以适当延长清洗时间并增加清洗频率。
6、二次抗体孵育
根据二抗说明书的指导，使用Western二抗稀释液适当稀释辣根过氧化物酶(HRP)二抗标记。
使用微型台式真空泵吸取洗涤液后，立即加入稀释的二抗，并在侧摆摇床上缓慢摇晃孵化一小时，温度保持在室温或4℃。取出二抗后，加入Western洗涤液，再次在摇床上缓慢摇晃清洗5-10分钟。将洗涤液吸取后再次加入洗涤液，继续清洗5-10分钟。总共需要进行3次清洗。如果结果背景较高，可以适当延长清洗时间，增加清洗的频率。
7、蛋白质的检测
使用BeyoECL和Western莹光检测试剂等ECL类试剂，根据相关说明书对蛋白质进行检测。
在片子处理的过程中，可以使用X光自动洗片机。如果没有自动洗片机，可以使用显影定影试剂盒，手工配置显影液和定影液来进行洗片处理。
8、薄膜再利用
如果蛋白质样品非常宝贵，可以使用Western一次抗体和二次抗体清除液来处理蛋白质膜，以便可以重复使用。

在实验时，需要注意以下三点事项：
1.安全第一：在进行实验时，必须要注意安全。要穿戴实验室所要求的防护装备，如实验服、手套、护目镜等，并遵守实验室的安全操作规程。
2.仔细观察：在实验过程中，要仔细观察实验现象和结果，注意记录和收集有关的数据和信息。只有充分观察和记录，才能得出准确可靠的实验结论。
3.保持实验环境整洁：实验室应保持干净整洁。实验结束后，要清理实验台、清洗实验器材，并将废弃物正确妥善处理。保持实验环境整洁有助于提高实验的效率和准确性。

实验中出现的问题及处理办法

【2023/10/26 17:33:58】